实验方法-实验概要
在真核和原核生物中,糖不仅是重要的能源和结构成分,而且是控制生理、代谢、细胞周期、发育和基因表达的中心调节分子。在高等植物中,糖影响生长和发育的整个生命过程,从种子萌发到开花直至最后衰老。越来越多的证据表明糖作为生理信号,调节着植物基本生理过程的许多基因的表达,包括光合作用、乙醛酸代谢、呼吸作用、淀粉和蔗糖的合成及降解、氮的固定作用、储藏蛋白的合成、病原防御、损伤反应、细胞周期的调节、色素的合成以及衰老反应。本实验用酶标法测定了拟南芥碳水化合物含量。
实验原理
1 mol的己糖经过酶反应,最终转化称6-Phosphogluconat均伴随着1 mo1NADPH的产生,通过测定NADPH在340nm的光吸收,即可测定样品中的己糖含量。
protocol" href="http://www.everlab.net/">protocol-主要试剂
1. 溶液的配制
1mM glucose
1mM fructose
1mM sucrose
500mM TRA buffer pH 7.4 TRA=triethanol amino
2M MgSO4
200 mM ATP
200mM NADP
以上的溶液均需于-20oC保存
Acetate buffer 0.1 M,pH 4.6
10ml 1N acetic acid(醋酸) 5m1 1N NaOH,加dd H20至90m1,调pH至4.6,定容至100mI。
2. 反应混合液(testmix)的配制((1 ml可点96孔,可根据需要配制一定体积,尽量少,因为酶价格较贵)
5ml TRA 500mM,pH 7.4(盐酸二乙醇胺溶于水,1 N NaOH调pH 7.4)
15ul MgS04(2M)
100ul ATP(200mM)
100ul NADP (200mM)
10ul Glucose-6-phosphat Dehydrogenase(G6P-DH,Grad II,140U/ mg)
3. 各种酶的配制
Hexokinase:用水1: 200稀释母液(母液浓度15000U/ml)
Phosphogluco-isomerase:用水1: 200稀释母液(母液配制:350U/mg10mg/ml)
Invertase:0.3mg干粉溶于1 ml醋酸缓冲液(pH4. 6,0.1 M)
Amyloglucosidase:6.09mg/ml (21.3U/mg)
实验步骤
1. 样品制备
1) 用液氮收集植物材料,将材料用冷冻真空干燥仪充分干燥,将干燥后的材料1密封保存在-20oC。
2) 称取2-4mg干燥的材料与l0mg PVPP,lmg活性炭充分混匀,沸水浴20分钟,置于冰上冷却。
3) 加入200ul重蒸水,充分研磨,室温放置25分钟。
4) 10000rpm离心10分钟。吸取100u1上清液,进行可溶性糖的测定。
5) 剩余部分加入100ul醋酸缓冲液(pH4.6 ),混匀后沸水浴15分钟,冷却至室温,加10ul amyloglucosidase充分混合,37oC水浴保温过夜。
6) 离心10min,取出100ul上清液,用作淀粉测定之用(可于-20 oC或-80 oC下保存备用)。
2. 酶标法测定
1) 葡萄糖、果糖、蔗糖的测定
a. 样品配制
按下表将各种成分混合
HG示空白对照,St为标准样品,sample为待测样品
b. 点样
将样品按下表顺序点入96孔比色板
每个样品测3个重复。
c. 测量
将比色板放入酶标仪读取数据,待读数稳定后记录。
取出比色板,将每个孔中加入稀释好的Hexokinase 10ul,放入酶标仪反应30分钟,其间每5分钟测量一次数据,将稳定后的数据记录。取出比色板,将每个孔中加入10ul稀释好的Phosphogluco-isomerase,放入酶标仪反应30分钟,其间每5分钟测量一次数据,将稳定后的数据记录。取出比色板,将每个孔中加入50ul稀释好的Invertase,放入酶标仪反应45分钟,将最后稳定的数据记录。
d. 计算
记录的每组数据及相关的实验参数输入计算软件,即可得到各样品中3种糖的含量。
2) 淀粉的测定
a. 样品配制
将经过Amyloglucosidase消化的样品按下表混合
根据样品淀粉含量的多少,水与样品的比例可适当调整在最后输入软件计算时,实验参数都应相应修改。
b. 点样
方法同上
c. 测量
将比色板放入酶标仪读取数据,待读数稳定后记录。取出比色板,将每个孔中加入稀释好的Hexokinase 10ul,放入酶标仪反应30分钟,其间每5分钟测量一次数据,将稳定后的数据记录。
d. 计算
将记录的每组数据及相关的实验参数输入计算软件,即可得到各样品中淀粉的含量。