骨髓染色体培养同步化操作方案
库巴扎新闻列表 | 2012-05-07

实验概要

本实验介绍了骨髓染色体培养同步化操作方法。

 

实验步骤

1. 培养制备

   1) 在室温或37±2℃的温度下解冻骨髓细胞染色体同步化套装培养管或培养瓶。

   2) 在无菌条件下添加1ml骨髓(加入的量由样本细胞密度决定)至一个试管中或分配5ml瓶装的介质到一个细胞培养瓶中并加入样本。

   3) 盖上培养管的盖子。

   4) 混合培养管(或培养瓶)中的物质,水平放置(在它的平坦的表面上),并在37±2℃的温度下温育。没有必要添加CO2, 因为该介质的构成就是为关闭系统中最佳的淋巴细胞扩散而设计的。

2. 培养同步化

   1) 经过48-72小时的培养后,添加0.1ml的溶液A并温育一整夜。

   2) 温育后,添加0.1ml的溶液B并温育5小时(没有必要清洗细胞)。

   3) 添加20ul秋水仙素(10ug/ml),并在37±2℃的温度下温育60分钟(大约)。如果要获得更多数量的前中期分裂相,可将温育时间减少至15分钟。

3. 染色体固定和玻片制备

   1) 温育后,如有必要,将培养转移至一个试管,并用离心机分离3-4分钟,转速为每分钟2.000(更快的转速不会损坏细胞)。

   2) 倒掉上层清液,注意不要使细胞粒子松散(推荐留大约0.5ml的物质在试管内)。

   3) 有力地重新悬挂粒子。

   4) 添加5ml低渗液(滴入H2O、0.56%氯化钾),并充分混合。

   5) 在室温下至少温育7分钟。

   6) 用离心机分离3-4分钟,转速为每分钟2.000。

   7) 根据步骤2倒掉上层清液。

   8) 有力地重新悬挂粒子。

   9) 添加5ml Ibraimov溶液(滴入H2O、5%醋酸),并充分混合。

   10) 立即用离心机分离3-4分钟,转速为每分钟2.000。

   11) 根据步骤2)倒掉上层清液。

   12) 有力地重新悬挂粒子。

   13) 添加5ml固定液(甲醇:醋酸,3:1),并充分混合。

   14) 重复步骤10-13。

   15) 立即用离心机分离3-4分钟,转速为每分钟2000。

   16) 仔细倒掉几乎全部的上层清液。

   17) 添加几滴新准备的固定剂,要考虑到滴数应当适合粒子内的细胞浓度。

   18) 滴一小滴细胞悬浮液到一块干净且湿润的显微镜玻片上。

   19) 放进Optichrome染色体分散仪内,在正确温度和相对湿度的恒定条件下蒸发。


原文地址: 骨髓染色体培养同步化操作方案


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